Mario, Luigi et Toad sont de la partie. Et comme si cela ne suffisait pas, Mopsie et Toadette se joignent également à l'aventure. Mopsie ne subit aucun dommage des ennemis, ce qui est vraiment pratique. Et lorsque Toadette attrape une Supercouronne, elle se transforme en Peachette. Peachette peut effectuer des doubles sauts, flotter en chute libre et s'échapper rapidement des gouffres avec un boost. Le premier rôle principal de Luigi dans l'aventure de saut et de course New Super Luigi U bénéficie également d'un traitement Deluxe. Un seul Joy-Con est nécessaire par joueur, permettant ainsi à jusqu'à quatre joueurs de participer à tout moment et partout dans 164 niveaux.